---

บทคัดย่อ

เคอร์ซินเป็น Ribosome-inactivating protein ซึ่งเป็นโปรตีนพิษจากพืช พบว่าเกี่ยวข้องกับระบบป้องกันตัวของพืชและสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ในการศึกษานี้ได้ทำการสกัดแยก RNA จากใบสบู่ดำสายพันธุ์ KUBP 78 และเปลี่ยนให้เป็น cDNA ของยีนเคอร์ซินด้วยวิธี RT-PCR นำผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่ได้มาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ BamHI และสอดใส่เข้าในเวกเตอร์ pTZ57R/T โดย cDNA ที่โคลนได้มีขนาดประมาณ 882 bp ซึ่งลำดับกรดอะมิโนมีความเหมือนกับโปรตีนเคอร์ซินอื่นๆ จากสบู่ดำถึง 95.2% โปรตีนเคอร์ซินที่สังเคราะห์นี้อยู่ในรูป pro-protein มีความยาว 293 กรดอะมิโน โดย 28 กรดอะมิโนแรกเป็น leader signal ซึ่งจะถูกตัดออกในกระบวนการนำส่งโมเลกุล และโปรตีนขนาด 265 กรดอะมิโนที่เหลือเป็น mature protein ของเคอร์ซิน ยีนเคอร์ซินที่เป็นส่วนของ mature protein ได้ถูกโคลนเข้าในพลาสมิด pET-17b และเหนี่ยวนำให้แสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli BL21(DE3) ด้วย 1 mM IPTG ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส จากการวิเคราะห์ด้วย MALDI-TOF MS พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีนที่ไม่ละลายน้ำนี้ มีมวลโมเลกุลประมาณ 28.98 กิโลดาลตัน เมื่อนำโปรตีนนี้มาตัดย่อยด้วยทริปซินและวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีนมีลำดับกรดอะมิโนเหมือนกับโปรตีนเคอร์ซินของพืชอื่น รีคอมบิแนนท์โปรตีนเคอร์ซินที่ได้นี้จะนำไปศึกษาคุณสมบัติ และทดสอบฤทธิ์ต้านเซลล์มะเร็งต่อไป คำสำคัญ: เคอร์ซิน สบู่ดำ รีคอมบิแนนท์โปรตีน

Abstract

Curcin, a ribosome-inactivating protein, is a toxic protein from plants. It was found to involve in plant defense system and bioactive compounds. In this study, total RNA was isolated from the leaves of Jatropha curcas KUBP 78 and used as template to synthesize the cDNA encoding curcin by RT-PCR. The PCR products were digested their termini with BamHI restriction enzyme and inserted into a cloning vector, pTZ57R/T. A cDNA of approximately 882 base pairs was obtained. The deduced amino acids sequence shared homology of 95.2% to those of curcin proteins from Jatropha curcas. The curcin was synthesized as a pro-protein consisting of 293 amino acids, the first 28 of which acts as a leader was cleaved and yielded the mature protein consists of 265 amino acids. The segment encoding the mature protein curcin gene was cloned into pET-17b plasmid and overexpressed as insoluble protein in Escherichia coli BL21(DE3) upon induction with 1 mM IPTG at 37oC. The insoluble recombinant protein was an apparent relative molecular mass approximately 28.98 kDa as determined by MALDI-TOF MS. Expressed protein bands were excised, tryptic digested and analyzed by LC-MS/MS. The results showed that the amino acid sequence of recombinant protein was similar to amino acid sequence of curcin in other green plants. The recombinant protein of curcin is further studied on characterization and anticancer activity. Keywords: Curcin, Jatropha curcas, Recombinant protein